肌肉靶向AAV(干扰/过表达/敲除)

   对于肌肉组织中使用的病毒载体通常会使用AAV,因为AAV不仅能够高效特异性地靶向肌肉组织,而且能在肌肉组织中持久表达。

不同血清型AAV的肌肉感染嗜性

  靶向肌肉的AAV血清型主要为AAV1, AAV6, AAV8和AAV9。其中,对骨骼肌和心肌的组织特异性以AAV8, 9较高
图1. 不同血清型在腓肠肌中载体表达情况[1]
 

启动子选择

常见启动子:CMV[2]、CAG[3]、MCK[4]

AAV在肌肉中注射方式

应用病毒载体感染肌肉组织进行研究,一般分为系统注射和肌肉内注射。
1、肌肉注射
一般选取鼠前后肢部位注射,注射时针头要垂直快速刺入肌肉,如无回血现象即可注射。肌肉内注射是一种定点注射,可以在注射点附近高效表达,但缺点是病毒扩散十分有限,因此往往需要多点注射,一般每个点在5-10uL。
2、系统注射
系统注射表达较均匀,但是大部分病毒会被其他脏器组织吸收,导致靶向肌肉的病毒较少。
3、尾静脉注射
从动物尾部的静脉注射病毒,以输送到全身各处肌肉。这种方式病毒表达较均匀,但是大部分会被其他脏器组织吸收,导致靶向肌肉的病毒较少。

实例展示

利用AAV载体介导营养不良小鼠肌肉和肌肉干细胞的体内基因编辑

载体: AAV9(AAV-SaCas9 + AAV-Ai9 gRNAs 或者AAV9-Dmd23 gRNAs);

注射方式:胫前肌(TA)原位注射&溶媒注射,每只小鼠注射病毒量7.5x1011vg;

启动子:CAGGS;

实验方法和结果:利用AAV9-CRISPR-Cas9核酸内切酶系统携带成对的gRNAs靶向识别并切除了DMD基因外显子23突变位点序列,成功构建了DMD外显子23缺失的mRNA转录本,恢复了小鼠体内具有生物学活性的抗肌萎缩蛋白DYSTROPHIN的表达。4周后免疫印迹,免疫荧光检测报告。
图1. 经过AAV9-CRISPR修饰的肌营养不良卫星细胞中DYSTROPHIN(抗肌肉萎缩蛋白)的回复性表达[5]

 
参考文献
[1]
Carmela Zincarelli, Molecular Therapy, 2008
[2]Weng S et al. Cancer Gene Therapy, 2020
[3]Adriouch S et al. Frontiers in microbiology, 2011
[4]Gatto F et al. Scientific reports, 2017
[5]Tabebordbar M . Science, 2016

 

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