肾靶向AAV(干扰/过表达/敲除)

  在体外,AAV对肾细胞具有广泛的向性,包括肾小球系膜、近端肾小管粗大上升肢、在原代培养中收集肾小管和RCC细胞。

不同血清型AAV的肾脏感染嗜性

肾脏常用载体有 AAV2、AAV8 和 AAV9。
图1. 不同血清型在肾脏中载体表达情况[1]
 

启动子选择

常用启动子:CMV[2]
 

注射剂量

注射病毒的滴度一般选择1-5×1011 GC/mL,稀释成50-200μL注射
 

AAV在肾脏中注射方式

  使AAV在肾脏中稳定持续表达可以通过尾接脉注射、肾脏皮质直接注射、肾动脉注射或输尿管逆行注射等注射方式。
1.尾接脉注射
尾静脉注射最为便捷,对肾脏也不造成任何损害,但目的基因蛋白在肾脏的表达量偏少。
2.其他注射方式
常见的注射部位还有肾脏皮质直接注射、肾动脉注射或输尿管逆行注射等方法。
研究表明,肾皮质注射只在注射位点周围肾小管上皮细胞中有GFP表达(Lipkowitz MS, J. Am.  Soc. Nephrol, 1999)。肾动脉注射同时夹闭肾动脉和肾静脉45分钟,可发现肾小管细胞有GFP表达。但病理提示,肾组织不仅有GFP表达,也合并炎症细胞浸润,肾小管萎缩和纤维疤痕组织(Chen S, J. Am. Soc. Nephrol,2003)。UUO模型中,通过夹闭输尿管,并经输尿管逆行灌注AAV的模型制作方法也可在部分肾小管上皮细胞中发现GFP有限表达(Ito K, BJU Int, 2008)。
因此,肾动脉、肾皮质直接注射或输尿管逆行注射的方法,都会对肾脏造成一定的损害,而且感染细胞主要是肾小管上皮细胞。

实例展示

使用合成的AAV能对肾间充质干细胞进行有效的基因传递

载体: AAV2/Anc80;

注射方式:眶后静脉注射。

启动子:CMV,CASI;

实验方法和结果:AAV2/Anc80注射后3周,取材切片免疫荧光染色共聚焦显微镜观察。

图2:AAV 2/Anc80表现出肾靶向性,在肾小球和间质中检测到报告基因eGFP高表达[2]

 
参考文献
[1]Carmela Zincarelli, Molecular Therapy, 2008
[2]Yoichiro Ikeda. J Am Soc Nephrol, 2018

 

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