肝靶向AAV(干扰/过表达/敲除)

  在肝脏相关研究中,利用AAV的高感染性,通过肝内或静脉注射的方式将目的基因带入组织细胞进行表达。因此,合适AAV血清结合肝脏特异性启动子,可实现对肝组织细胞的稳定转染,及外源基因在血液循环、靶组织中治疗水平的表达。
 

不同血清型AAV的肝脏感染嗜性

        AAV8 能跨越存在于内皮细胞和血管之间的屏障而转染该组织和细胞,与其他血清型AAV载体相比,AAV8载体转导肝脏的效率提高了10-100倍。AAV7、AAV9和AAV-DJ也可用于肝脏研究。
图2 不同血清型在肝脏中载体表达情况[1]
 

启动子的选择

常见启动子:CMV[2]、hAAT[3]、TBG[4]
 

AAV在肝脏中注射方式

1.肝内注射
肝内注射具有特异性强的优点。
 
2.静脉注射
静脉注射后,AAV显示出显著的肝脏趋向性。静脉注射包括肝门静脉注射和尾静脉注射。研究表明,从大鼠门静脉和尾静脉给予rAAV都可以观察到肝脏中较高水平的目的基因表达,而且大多数文章报道这种表达可以持续至少6个月,没有发现炎症等不良反应,从门静脉注射比尾静脉的表达水平高50%左右。
 
3.其他注射
其他还有腹腔注射和肌肉注射等方式,其中肌肉注射特异性稍差,应用较少;腹腔注射较为常规,且操作简单。
 

注射剂量

以乙型血友病为例的AAV注射剂量[5]
注:此表仅作参考,不同注射方式剂量会有所不同,请以预实验结果为准。
 

AAV在肝脏疾病中的应用

1.AAV在肝脏先天性疾病基因治疗中的应用
先天性血色病是由先天性铁代谢异常造成的铁过量沉积于肝脏、胰脏和心脏等实质器官导致的疾病。有报道指出,携带目的基因FIX的rAAV5或rAAV8通过静脉注射后,可经门静脉循环后进入肝脏内部发挥作用,对先天性血色病B的治疗有效。

2.AAV在肝脏肿瘤基因治疗中的应用
抑制肿瘤内的血管生成是一种公认的肿瘤治疗方法。通过使用AAV 携带拓扑异构酶抑制剂内皮他丁的基因序列,转入肝癌小鼠模型中,虽然并没能起到抗肝癌的作用,但却增强了肿瘤的响应。AAV介导的次级淋巴组织趋化因子在实验模型体内的局部表达可刺激瘤床,产生强抗肿瘤作用。

3.AAV在肝纤维化及相关疾病基因治疗中的应用
AAV的介导INF-γ能有效抑制肝星状细胞的活性,使平滑肌肌动蛋白α-SMA和TIMP-1、转化生长因子TGF-β 在mRNA水平上的降低,在体内实验中可有效抑制肝纤维化的进程。此外,将INF-α和INF-γ,IL-10和IL-12通过AAV为载体直接将目的基因转入细胞,均能起到抗肝炎病毒的作用。通过AAV负载刺激树突状细胞,使之提呈抗原给细胞毒性T淋巴细胞,可产生特异性的杀伤作用,也具有抗肝炎病毒效果。
 

实例展示

  • 利用AAV-CRISPR介导的直接法体内筛选技术,绘制小鼠肝脏肿瘤抑制子的功能性癌症基因组图谱
  • 载体:AAV9- CRISPR-mTSG sgRNA;
  • 实验动物:小鼠
  • 注射方式:尾静脉注射;
  • 启动子:U6;
  • 实验方法和结果:利用AAV在Cre依赖CRISPR–Cas9小鼠的肝脏内介导单向导RNA(sgRNA) library表达,进行诱变。注射后0-4个月、取材切片MRI和荧光立体亮视野显微镜观察。
 
图3.  MRI显示AAV9-mTSG组注射后成瘤(上);注射4个月后荧光显微镜观察mTSG组肝脏大量GFP+肿瘤结节(下)[6]
 
参考文献:
[1]Carmela Zincarelli, Molecular Therapy, 2008
[2]Dalwadi DA et al. Molecular Therapy, 2020.
[3]Xia Y et al. Molecular Oncology, 2020.
[4]Fuchs SP et al. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2020
[5]Kenneth I. Berns. Gastroenterol Clin N Am, 2019
[6]Wang et al., Sci. Adv. 2018

 
 
 

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