稀疏标记

简介

  稀疏标记通过重建单个神经元全细胞形态的投射模式,精确解析单个神经元在神经环路中的形态结构。因此,该技术不仅能够重构全脑范围的单神经元投射形态,还能解析单神经元信息输入输出位点,为了解单神经元如何形成复杂多变的神经环路提供支持。
 

稀疏标记的方法

  常用稀疏标记方法主要包括病毒标记以及转基因小鼠遗传学标记等,其中病毒标记方法以重组腺相关病毒(rAAV)的应用最为广泛。
  YSB易博胜中心采用双包装质粒鸡尾酒法制作制作rAAV稀疏标记载体。该方法将双核心表达质粒预混合后,与携带Rep基因(AAV复制蛋白)、Cap基因(AAV血清型结构蛋白)的包装质粒,携带腺病毒辅助包装基因的包装质粒混合后共同转染HEK293细胞,进一步纯化获得单一rAAV集合。
  
其他常用的稀疏标记方法有:
  1. Cre剪切酶依赖:将高倍稀释表达Cre剪切酶的rAAV病毒与Cre剪切酶依赖表达荧光蛋白的rAAV病毒混合后注射小鼠大脑特定脑区。
  2. Cre-ER转基因小鼠他莫昔芬依赖:通过控制他莫昔芬药物剂量,在Cre-ER转基因小鼠中,诱导特定细胞类型神经元的稀疏标记。
  3. 四环素诱导系统泄露机制依赖:该方法利用四环素诱导表达系统的泄露机制,失效特定或非特定细胞类型神经元。
  4. 突触末梢浸入限定感染数目:该方法通过逆向运输表达Cre剪切酶的病毒,控制神经元轴突末梢侵入限定感染数目,启动上游神经元中Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达,实现游目标脑区神经元的稀疏标记。

图1. 逆向稀疏标记示例(Han Y et al. Nature, 2018)
 

YSB易博胜中心稀疏标记的优势

1. Simple:注射一种AAV即可实现稀疏标记;
2. Efficient:3倍高亮度标记神经元精细形态和长程投射;
3. Controllable:可有效标记50-100个神经元;
4. Stable:标记数目稳定
5. Versatile:已在至少40个脑区有效应用
6. Well-separated:单个神经元间分离度高
7. Cell-specific:可标记特定类型神经元
8. Extensive-use:可与fMOST、组织透明化等技术联用

 
 
 

案例展示

实验动物:C57BL/6J小鼠
病毒载体:BC-SL001
实验方法和结果:Cre剪切酶表达质粒与Cre剪切酶依赖的荧光蛋白表达质粒分别以特定比例预先混合包装制作成单一rAAV集合,注射C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层。结果显示,包括树突棘和轴突小结在内的目标神经元局部形态被高清标记。

 
神经元局部精细形态展示
图2. AAV注射C57BL/6小鼠大脑初级运动皮层的标记效果(P Sun, S Jin, et al, Preprint, 2019)
 

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