基因编辑

CRISPR/Cas基因编辑系统

       CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas)系统是目前被广泛运用的基因编辑系统,其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列,对序列进行切割。
   
图1. CRISPR/Cas9基因编辑示意图(图源:Wellcome Trust Sanger Institute,Sanger)
 

CRISPR/Cas基因敲除

       CRISPR/Cas9系统中sgRNA(smallguideRNA)识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂(double-strandbreak,DSB),机体自身通过非同源重组(non-homologousendjoining,NHEJ)的方式修复DSB,参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基,修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失,从而实现机体内的基因敲除。
应用:基因敲除细胞系建立、基因敲除建立动物疾病模型。
技术优势:相较于在mRNA水平“敲低”目的基因的RNAi而言,CRISPR/Cas9系统造成基因序列的缺失,从而能完全沉默(即敲除)目的基因。

CRISPR/Cas基因敲入

       CRISPR/Cas9系统中sgRNA(smallguideRNA)识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂(double-strandbreak,DSB),通过细胞内的同源重组(homologousrecombination,HR)修复方式,将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中,从而实现基因敲入。
应用:基因片段敲入细胞系建立、基因单碱基突变细胞系建立、基因敲入建立动物疾病模型。
技术优势:操作简易、效率高、具有广谱性且提供BSL-1和BSL-2病毒注射及实验操作平台。

CRISPR/dCas9调控内源基因的转录激活与抑制

       CRISPR-dCas9系统即是dCas9与转录激活因子(如VP64)或转录抑制因子(如KRAB)融合后,结合sgRNA能促进或抑制目的基因的表达。
应用:目的基因在内源环境中过表达、诱导iPSC、抑制表达等。
技术优势:操作简易、效率高、具有广谱性且提供BSL-1和BSL-2病毒注射及实验操作平台,同时可与RNAi联合作用。

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