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  • Q.如何判断DNA质量/纯度?

    A.答案
    人们通常使用260nm和280nm(A260/A280)的吸光度比值来衡量样本纯度。对于DNA而言,理想的比值为1.8,容许的范围在1.7-1.9之间。同时,A260/A230的比值也可用于检验样品是否存在其他物质的污染。DNA分子的理想比值范围在1.8-2.0。DNA的纯度也可通过琼脂糖凝胶电泳来检验。例如若是基因组DNA,需要观察长片段的平均大小。若是质粒DNA,应出现一条明显的单一条带(可能会出现几条额外条带,代表质粒分子的多种形式)。
  • Q.设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些?

    A.答案
    稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有:1)外源插入片段的拷贝数,2)外源基因整合的几率,3)整合位点的转录活跃度,4)整合后的稳定性,5)使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
  • Q.如何提高RNA细胞转染效率?

    A.答案
    1)纯化RNA
    在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。
    2)避免RNA酶污染
    微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
    3)健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
    通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。
  • Q.细胞转染实验影响因素有哪些?

    A.答案
    1)转染试剂
        不同细胞系转染效率通常不同,但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。
    2)细胞生长状态
        一般低的细胞代数(<50)能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞,细胞生长旺盛,最容易转染。
    3)转染方法
        因不同实验室培养的细胞性质不同,质粒定量差异,操作手法上的差异等,其转染效果可能不同,应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。
    4)载体结构
        转染载体的构建(病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等)影响转染结果。除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响。
  • Q.病毒感染细胞实验中,使用感染增强剂出现细胞毒性的原因是什么?

    A.答案
    1)增强剂用量过大,可适当减少其用量;
    2)病毒量过大,可适当减少病毒用量,可采用更换培养基或增加培养基量的方法。
  • Q.用于病毒感染的细胞接种量多少为宜?

    A.答案
    1)根据细胞增殖速度决定接种量,一般需保证感染后4天左右细胞刚好快长满培养皿底部。
    2)对于大部分细胞系:传代周期2-3天,感染时细胞铺板密度保持在20%-30%范围内。
    3)对于某些原代细胞:细胞生长缓慢,接种时汇合度可提升至50%-60%,保证感染后4天左右细胞汇合度达到90%-100%。
    4)对于非分裂细胞:接种后不再增殖(如神经元细胞),按照汇合度100%进行接种。
  • Q.加入病毒后,细胞死亡严重,是什么原因?该如何处理?

    A.答案
    一般是病毒对细胞具有一定毒性,可调整、降低感染MOI值。并密切关注细胞状态,在感染后4、8、12小时定时观察细胞情况。若出现细胞状态变差情况,立即对细胞进行换液处理,使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。
  • Q.如何提高病毒感染效率?

    A.答案
    病毒感染效率受多个因素影响,包括细胞自身生长状态、细胞数量、细胞被感染的难易程度等。因此在实验过程中,保证细胞正常增殖、轮廓清晰,同时保持合适的细胞密度,选择最佳感染条件可更好保证感染效率。
    对于悬浮细胞,可采用离心感染的方法,减少病毒感染时的体积,从而提高感染效率。如培养板密封,可用平角转子离心机1000 g离心1 hrs,再放回培养箱中继续正常培养。
  • Q.细胞能被病毒感染,但为什么GFP荧光很弱?

    A.答案
    GFP病毒感染细胞后,细胞荧光强度取决于病毒进入细胞颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP基因启动子活性等因素。因此,目的细胞感染病毒颗粒数越多、细胞增殖越快,GFP荧光会较强。
    其次,病毒在增殖较快的细胞中感染96-120 hrs后,GFP蛋白表达才达到峰值;在增殖较慢的细胞中,这一时间更长。
    此外,强启动子后的GFP基因荧光表达强,反之,弱启动子后面的荧光表达较弱。
  • Q.电穿孔转染效果不佳,其影响因素可能有哪些?

    A.答案
    若电转效果不佳,可考虑一下条件进行优化:
    1. 电场参数
        不同细胞系具有不同的最佳场强值,其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外,还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数,故可间接测定存活率来确定最佳场强值。
    2. 脉冲过程
        ①脉冲波形主要分为两种,方波脉冲和指数递减波脉冲。一般哺乳动物细胞电转选择方波脉冲,细菌、酵母菌、昆虫细胞选择指数递减波脉冲。
        ②脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中,脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中,脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间,等于电容(C)与电阻(R)的乘积,单位是ms。在参数优化中,增加电压应当降低脉冲时间,而减小电压则应当增大脉冲时间。
        ③一般而言,对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲,因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。
    3. 细胞因素
        用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d)。细胞悬液浓度一般为1*106/ml,当细胞生长密度大于3*106/ml,转染效率会下降。
    4. 质粒因素
        从质粒浓度看,细胞密度为1*106/ml,DNA用量在2-5 μg/ml转染效率最高。
    5. 温度
        一般情况下,电转的过程是在室温下进行,但在电击前后需对细胞进行冰浴处理。
    6. 电转后培养液的选择
        细胞在电击后十分脆弱,其培养液的选择应注重提高细胞的存活率,一般选择 低渗的RPMI 1640+10%FCS。除此之外,可参考加入50 mmol/L海藻糖+1.25%DMSO。
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